Bipolar sarmal yapı

Bir Enzim DNA’yı Nasıl Çözer?

 DNA replikasyonu, iki özdeş sarmal üretmek için bir DNA sarmalının kopyalandığı karmaşık bir prosedürdür. Bu sarmallardan biri “ebeveyn” DNA’sıdır ve diğer ikisi yavru sarmallardır. Bu replikasyon yarı-korunumludur, çünkü bir ana sarmal her zaman yavru sarmala geçer. Yine de, sürecin bir sorunu var: ipliklerden biri geride kalıyor ve bu da birkaç kısa parçaya neden oluyor. DNA ligazın devreye girdiği yer burasıdır. Enzim, Okazaki parçaları olarak bilinen bu parçaları birleştirerek tek bir DNA molekülü oluşturur.

RecBCD enzimi

RecBCD enzimi, ds DNA’yı 4-nt 5′ çıkıntılı bir ds DNA bölgesine bağlayarak çözer. Bağlanma afinitesi, Mg2+ iyonlarının varlığında ve 5-nt uzatma uzunluğunda arttı. Başka bir çalışma, RecBCD enziminin, yedi veya onluk bir 4-nt 5′ sarkıntıyla ds DNA’nın bir bölgesine bağlanabildiğini gösterdi.

RecBCD enzimi, monomerik veya dimerik formlarda mevcut olabilir. Enzim ss DNA’sını bağladığında, monomer A onu bağlarken, monomer B hemen önündeki ds DNA’sını bağlar. DNA bağlandıktan sonra helikaz enzimi RecC tünelinin çıkışına doğru geri döner. RecBCD enzimi daha sonra daha fazla nükleaz aktivitesini önlemek için döner.

Bu yönteme ek olarak, dsDNA’nın RecBCD aracılı çözülmesini görselleştirmeye yönelik başka bir yöntem, çok kanallı bir akış hücresini içerir. Bir şırınga pompası, biri RecBCD-DNA boncuk kompleksini, diğeri ATP’yi içeren iki kanalı birbirine bağlar. Optik tuzak, enzim-DNA-boncuk kompleksinin hareketini büyütmeye yardımcı olur. Akış, floresanla hapsolmuş dsDNA’yı genişletir.

kutuplu helikaz yapısı

Çeşitli deneyler, RecBCD’nin iki motor alt birimli iki kutuplu sarmal yapıya sahip olduğunu göstermiştir. İlk alt birim olan RecD’nin tanımadan önce önde gelen motor alt birim olduğu varsayılır. Yavaş RecB motor alt biriminin, kh pozisyonundaki duraklamayı açıklayan kh tanıma işleminden sonra RecD’ye yetişeceği düşünülmektedir. Bu süre zarfında, ikinci alt birim olan RecB, etiketlenmemiş DNA, ikinci monomerin toplanmasını engeller.

RecBCD Enziminin Saflaştırılmış Monomerik Formu DNA’yı Bağlar. Proteine ​​bağlı DNA tipik olarak poliakrilamid jelde DNA’nın göçünü engeller. Bununla birlikte, kısa DNA molekülleri, protein göçünü engellemeyebilir. Protein, Chi dizisi adı verilen ve bazen Yunanca a harfiyle gösterilen belirli bir diziye bağlıdır. RecBCD enzimi ayrıca Chi dizisine bağlanır.

DNA ve RNA duplekslerini gevşetin

RNA helikazları, DNA ve RNA duplekslerini çözen proteinlerdir. Dubleksleri çözmek için dsRNA çekirdeğindeki fosfat parçasını çözerek nükleotid değişim faktörleri olarak hareket ederler. Bu dublekslere özgüllükleri, A-formu ve B-formu DNA ile etkileşimleri tarafından belirlenir.

Helikazın güvenli durumunun kararlılığı, nükleotitler ve RNA ile etkileşimlerine bağlıdır. Ayrıca DEAH ailesi, ATP g-fosfat ile zayıf etkileşimlerle karakterize edilir; bu, lokalizeden translokasyona dayalı çözmeye geçişi destekleyebilir. Bu nedenle, lokalizeden translokasyona dayalı çözmeye geçiş, evrimle gerçekleşmiş olabilir. Bu, RNA helikazlarının DNA ve RNA metabolizmasındaki rolünü anlamak için önemlidir.

Bazı helikazlar, çatallı bir substrat gerekliliğini atlayabilir ve bir ssDNA veya RNA dupleksinde hareket edebilir. İkinci durumda farklı tek sarmallı bölgelere sahip ssDNA ve RNA dupleksleriyle sınırlıdırlar. Tek sarmallı bölgeler ayrıca bu enzimlerin yönlülüğünü de belirler. Bazı sarmallar ssDNA üzerinde hareket edebilir, ancak dsDNA üzerinde hareket edemez.

DNA ve RNA helikazları

DNA ve RNA helikazları, hücre yaşamındaki birçok temel olayda yer alır. Nükleotid eksizyon onarımında, transkripsiyon-bağlı onarımda ve telomer metabolizmasında çok önemli bir rol oynarlar. Bununla birlikte, helikaz aktivitesi, çeşitli mekanizmalar tarafından in vivo olarak düzenlenir. Bu nedenle, bireysel helikazların izolasyonu ve bunların hücre tarafından düzenlenmesi, biyolojik yolların nasıl çalıştığını anlamak için önemli yeni bir araç sağlayabilir.

Aktif helikazlar, çift sarmallı DNA ve RNA’yı sıkıştıran ve açan proteinlerdir. Ek olarak, RNA helikaza bağlı transkripsiyon gibi potansiyel düzenleme mekanizmalarına sahiptirler. Bu enzimler hücre replikasyonu, onarımı, transkripsiyonu ve rekombinasyonu için önemlidir. Birçok insan geni helikazları kodlar. Helikaz genlerindeki mutasyonlar, Xeroderma pigmentosum ve Werner sendromu dahil olmak üzere hastalıklarla bağlantılıdır.

DNA çözme kinetiğini inceledik

T7 DNAP çalışmasında, T7 DNAP’nin sarmalları geri sarma hızını belirlemek için floresan boyalar (floresein) kullanarak DNA çözme kinetiğini inceledik. Duplekslendiğinde, flüoresan etiketli gecikmeli şeritler BHQ1 tarafından söndürülür ve flüoresan etiketli öncü şeritler, T7 DNAP, E. coli SSB kullanarak şeritleri çözdüğünde artar.

Önce tek bir dsDNA uzunluğunda çözme parametrelerini inceledik ve daha sonra kinetik parametreleri belirlemek için çok sayıda dsDNA kullandık. Farklı GC bileşimlerinin, dNTP havuzlarının ve SSB’nin etkisini de inceledik ancak floresan verilerinin nasıl kalibre edileceği konusuna değinmedik. Çalışmamız, DNAP’nin tek başına DNAP ve DNAP ve Helikaz için farklı çözme oranlarıyla iki fazlı davranış sergilediğini öne sürüyor.

DNA polimeraz ve Helikaz birleştirildiğinde, DNA sarmallarını helikaz tarafından uyarılmış bir oranda çözebilirler. Bu yöntem, birleşik enzimler DNA’yı aynı anda çözdüğü için DNA’nın nasıl çözüldüğünü incelemek için özellikle yararlıdır. Kombine enzimler bunu yaparken oldukça verimlidir. Bu süreci araştırmaya ve mevcut olduğunda bu bilgileri güncellemeye devam edeceğiz.

DNAP ve Replication Helix, tandem bir tarzda birlikte oluşur. Bakteri hücrelerinde helikaz ve DNAP aynı yerde birlikte bulunur. Helikaz, dubleks DNA’nın çözülmesinden sorumluyken, DNAP, çatal bağlantısının yakınında ds DNA’sını kararsız hale getirir. Bu mekanizma, replikasyon makinesinin DNA’yı nasıl çözdüğünü açıklar. Koordinesiz çözülme DNA parçalanmasına neden olduğundan, iki enzim arasındaki karşılıklı bağımlılık esastır.

DNA ligazları bir enzim sınıfıdır

DNA ligazları, DNA’yı çözen bir enzim sınıfıdır. Çoğu insan dokusunda düşük seviyelerde ifade edilirler. Yine de, ilk mayotik bölünmeden önce yalnızca birincil spermatositlerde ifade edildikleri testislerde önemli ölçüde yükselirler. Eşsiz bir ekleme mekanizması, yalnızca erkek germ hücrelerinde bulunan farklı mRNA türleri ile sonuçlanır. Bu mRNA’lar, DNA molekülünün C-terminal bölgesinde meydana gelen bir değiştirme sekansı içerir.

DNA ligazlarının DNA’yı nasıl çözdüğüne dair kesin mekanizma hala bilinmemekle birlikte, mekanizma tamamen spekülatif değildir. Katalitik alanlar ve çentikli DNA’ya bağlanma mekanizması dahil olmak üzere çeşitli faktörler rol oynayabilir. DNA ligaz III, NTaz’a oldukça benzerdir ve aktivitesi, DBD’deki anahtar kalıntılara bağlıdır. Moleküller arası ligasyon, trans halindeki iki DNA ligaz III molekülü arasındaki etkileşimi içerir.

DNA ligazları, merkezi dubleks ve kapalı PCNA halkasını çevreleyen karmaşık bir 3 alanlı yapı ortaya çıkarır. En büyük iki alan, PCNA altıgen halkasını düz kenarlarından bağlar ve üçüncü sarkık alan, DNA çubuğunun tepesiyle temas eder ancak PCNA ile etkileşime girmez. Bu yapı, DNA-ligaz-DNA etkileşimi için bir iskele görevi görebilir.

DNA ligazları IIIa ve I aynı olmasalar da, çok benzer işlevlere sahiptirler. Ligaz IIIa, C-terminalinde bulunan küçük bir ilave amino asit sekansı dışında Ligl’e daha benzerdir. DNA ligaz IIIb’nin C-terminali, NLS ile ilişkilidir. DNA ligazları IIIb ve I çok benzerdir, ancak C-terminal DNA ligaz IIIb, Ligl’den daha fazla amino asit içerir.

Moleküler bir makine DNA’yı çözüyor

Yeni bir çalışma, moleküler bir makinenin DNA’yı nasıl çözdüğünü gösteriyor. California Üniversitesi, Davis ve Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı’ndan araştırmacılar, DNA’nın çözülmesini filme almak için bir cihaz geliştirdiler. Makine, çift sarmalı RecBCD adlı bir enzimle çözebilir. Bu enzim DNA’ya bağlanır ve onu çözerek boyunca hareket eder. Araştırmacılar sonuçlarını Nature dergisinin 18 Ocak sayısında yayınlamayı bekliyorlar.

DNA replikasyonu birkaç farklı enzim ve protein içerir. DNA sarmalı, DNA polimerazın önündeki çift sarmalı açar. Ligaz ve primusse gibi diğer enzimler, tek sarmalın yeniden birleşmesini engeller. Son olarak, tek sarmal bağlayıcı proteinler veya SRB’ler, tek sarmalların birleşmesini engeller. DNA replikasyonunda yer alan enzimler arasında DNA helikaz, polimeraz I ila III, ligaz, primaz, topoizomeraz vb.

DNA helikaz F ve SRB

DNA helikaz F ve SRB, DNA’yı çözen en yaygın enzimlerden ikisidir. Her iki enzim de azotlu bazların hidrojen bağlarını kırarak çalışır. Helikaz, replikasyon çatalının açılıp kapanmasından sorumludur ve tek sarmal bağlama proteinleri, yeni açılmış sarmallara bağlanır. Bu işlem, DNA polimeraz III’ün DNA sarmalının 3′ ucuna nükleotitler eklemesine izin verir.

Özetle, DNA’nın çözülmesinden sorumlu enzim RNA polimerazdır. Bir genin promotör bölgesine bağlanır ve DNA’ya gevşemesi için sinyal verir. RNA polimeraz daha sonra, DNA’nın şablon ipliği üzerinde tamamlayıcı baz çiftleri oluşturmak için bir mRNA molekülü oluşturur. Enzim daha sonra işlemi tamamlamak için sarmalın 3′ ucuna yeni bir nükleotit ekler.